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牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL)說明書
真核生物中mRNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄后修飾在5'端形成一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)，即帽子結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對(duì)mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)與翻譯過程均有較重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子結(jié)構(gòu)的有效酶，其由D1和D12兩個(gè)亞基組成，兼具RNA三磷酸酯酶活性、鳥苷?；D(zhuǎn)移酶活性和鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可將7-甲基鳥嘌呤帽結(jié)構(gòu)（m7Gppp）連接到RNA的5'末端（m7Gppp5'N）。牛痘病毒加帽酶，在合適濃度的加帽緩沖液（Capping buffer），鳥苷三磷酸（GTP），S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等存在條件下，能夠在一個(gè)小時(shí)之內(nèi)對(duì)RNA進(jìn)行加帽，并且保證正確的方向。
本品以無菌液體形式提供，可應(yīng)用于體內(nèi)/體外翻譯前mRNA的加帽反應(yīng)或mRNA的5'末端標(biāo)記反應(yīng)。
產(chǎn)品組分
組分名稱 | 產(chǎn)品編碼/規(guī)格 | ||
78MRNA-1105A（500 U） | 78MRNA-1105B（2000 U） | 78MRNA-1105C（10000 U） | |
10×Capping Buffer | 150 ul | 500 ul | 1.25 mL×2 |
SAM(32mM) | 50 ul | 200 ul | 1 ml |
RNase free water | 1ml | 1ml | 1mlx3 |
Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL) | 50 ul | 200 ul | 1 mL |
產(chǎn)品性質(zhì)
來源（Source） | 攜帶牛痘病毒加帽酶基因的E. coli |
最適溫度（Optimum Temperature） | 37℃ |
儲(chǔ)存緩沖液（Storage Buffer） | 20 mM Tris-HCl pH 8.0，100 mM NaCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，0.1% Triton X-100，50%甘油 |
活性單位定義（Unit Definition） | 37℃條件下，1小時(shí)內(nèi)將10 pmol GTP（α- 32P）摻入到一條含80個(gè)核苷酸（80 nt）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上所需要的酶量，即為1個(gè)單位。 |
產(chǎn)品應(yīng)用【 加帽反應(yīng) 】適用于10 μg RNA（≥100 nt）的加帽反應(yīng)，反應(yīng)體系20 μL，且可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要放大。1. 取10 μg RNA，用RNase free water將適量RNA稀釋至15 μL；2. 將RNA置于65℃加熱5 min，結(jié)束后冰上放置5 min；3. 按照右側(cè)表格依次加入各組分；4. 37℃反應(yīng)30 min；5. RNA加帽完成，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
| 組分 | 體積 |
| Denatured RNA | 15 ul |
| 10×Capping Reaction Buffer | 2 ul |
| GTP (10 mM) | 1 ul |
| SAM (2 mM) | 1 ul |
| Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μL) | 1 ul |
| Total volume | 20ul |
【 5′ 末端標(biāo)記反應(yīng) 】本步驟適用于 5′末端帶有三磷酸的RNA標(biāo)記，且可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要放大。其標(biāo)記效率受反應(yīng)體系中RNA與GTP摩爾濃度比以及RNA樣本中GTP含量影響。1. 用RNase Free Water將適量RNA稀釋至14 μL；2. 將RNA置于65℃加熱5 min，結(jié)束后冰上放置5 min；3. 按照右側(cè)表格依次加入各組分；4. 37℃孵育30 min；5. RNA 5′末端標(biāo)記完成，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
| 組分 | 體積 |
| Denatured RNA | 14 ul |
| 10×Capping Reaction Buffer | 2 ul |
| GTP Mix | 2 ul |
| SAM (2 mM) | 1 ul |
| Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μL) | 1 ul |
| Total volume | 20 ul |
*注：GTP Mix為GTP和少量標(biāo)記物，GTP儲(chǔ)液應(yīng)稀釋為反應(yīng)體系中mRNA摩爾濃度的1~3倍。 注意事項(xiàng)：（1）用于加帽反應(yīng)的RNA在使用前應(yīng)進(jìn)行純化并溶解于RNase free water 。溶液中不能含有EDTA和鹽。（2）加帽酶反應(yīng)前加熱RNA可以去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5′的二級(jí)結(jié)構(gòu)。如果轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5′端結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可將加熱時(shí)間延長至10 min。（3）如果轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5′端結(jié)構(gòu)復(fù)雜，為提高加帽效率可將反應(yīng)時(shí)間延長至120 min。（4）SAM在室溫下會(huì)逐漸降解，SAM降解會(huì)導(dǎo)致N 7 甲基化效率降低，會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致加帽失敗，因此需始終放置在冰上。此外，也可以通過體系優(yōu)化適當(dāng)提高用量以保證加帽反應(yīng)順利進(jìn)行。 其他用途可參考上述用途或相關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
運(yùn)輸和保存方法
干冰運(yùn)輸。-20 oC保存，避免反復(fù)凍融，有效期1年。
注意事項(xiàng)
1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作；
2. 所提取的RNA需經(jīng)過純化并使用無核酸酶的水重懸；
3. 在加入酶之前需要對(duì)RNA溶液進(jìn)行加熱以去除5'末端的二級(jí)結(jié)構(gòu)；
4. 對(duì)于已知5'末端結(jié)構(gòu)的RNA，可以延長反應(yīng)時(shí)間至60分鐘，提高加帽效率；
5. 5'末端標(biāo)記反應(yīng)體系中，GTP儲(chǔ)液應(yīng)稀釋為反應(yīng)體系中mRNA摩爾濃度的1-3倍。
| 貨號(hào) | 品名 | 規(guī)格 | 品牌 |
| 78MRNA-1105A | 牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL) | 500 U | BIOHUB |
| 78MRNA-1105B | 牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL) | 2000 U | BIOHUB |
| 78MRNA-1105C | 牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL) | 10000 U | BIOHUB |
